成人关节软骨细胞增殖与人参皂甙Rg1的促进作用
背景:人参总皂甙的主要有效成分为人参皂甙Rg1,有促进细胞增殖、抗衰老、抗细胞凋亡、抗炎及抗自由基等作用,但以往实验对象多为鼠、兔等动物的关节软骨细胞。
目的:体外培养成人软骨细胞,观察人参皂甙Rg1对体外培养的成人关节软骨细胞增殖的促进作用。
方法:
实验分2组,Rg1组使用含质量浓度为40mg/L人参皂甙Rg1的DMEM培养液培养,对照组使用未加人参皂甙的DMEM培养液培养,每日应用倒置相差显微镜观察细胞生长情况至第7天,并进行细胞计数。同时培养至第6天检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达。
结果与结论:
对照组自培养第2天起细胞进入对数增殖期,到第7天细胞数约为接种时的8倍。Rg1组自培养第2天起细胞增殖能力较对照组增强(P<0.05),到第7天细胞数约为接种时的18倍(P<0.05)。免疫组织化学SABC法检测结果显示,Rg1组与对照组细胞胞浆均可见Ⅱ型胶原表达,两组差异无显著性意义(P>0.05)。
说明人参皂甙Rg1可促进成人软骨细胞的增殖。
机 构:
郑州大学第一附属医院骨科;郑州大学第四附属医院中医科;河南省洛阳正骨医院;
人参皂甙Rg1对成人软骨细胞及
膝骨性关节炎的影响
膝骨性关节炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是一种常见的退行性骨关节疾病,多发于中老年人。该病致残率高,严重地威胁着人类的健康,迄今为止还没有发现预防该病发生的有效方法。
由于软骨组织中没有血管和神经,关节软骨损伤后几乎不能完全修复，而KOA的发病机制也主要牵涉软骨细胞和软骨基质两个方面。关节软骨的改变是在本病发生发展过程中最主要的病理过程，所以预防和延缓软骨细胞组织的退变,促进软骨的修复，一直是骨关节内外科共同面临的难题。
祖国医药在骨关节病的临床防治中积累了丰富的经验，益寿轻身、大补元气的人参及人参单体和人参复方药物在膝骨性关节炎的防治过程中发挥着重要的作用，也是近十年的研究热点。
区别以往软骨细胞供体大多为动物或处于幼稚状态软骨的研究，我们选取膝关节置换术中取下的成人软骨组织自培养传至第3代后，通过使用细胞学、分子生物学、生物化学等多种检测方法对40μmol/L人参皂甙Rg1促进成人关节软骨细胞(Adult Human Articular Chondrocytes, AHACs)的增殖情况进行观察，并通过检测细胞培养上清和细胞超声波裂解物内的碱性成纤维样生长因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)的表达水平来分析人参皂甙Rg1单体的作用机制，为人参皂甙Rg1用于细胞组织工程及修复关节软骨损伤提供更充分的理论依据，也为以后研究中药起效的细胞作用靶点提供新的思路。
人参皂甙Rg1作为参麦注射液(人参复方药物)在防治心脑血管疾病方面的主要有效成分，在临床防治KOA方面的疗效与参麦注射液相比是否同样确切安全，在临床方面还未见相关研究及报道。
所以我们设计了严格的实验，临床小范围内观察人参皂苷Rg1溶液对膝骨性关节炎的疗效，以期提供防治KOA的新方法，为新药的研制和应用做好铺垫。
第一部分：AHACs体外分离、培养与鉴定 1方法 取膝骨性关节炎患者进行假体置换时截下的关节软骨,进行机械分离、漂洗、酶分离及过滤后,得到AHACs原代细胞(Passage0, PO) 进行培养，用台盼蓝排斥实验对PO AHACs进行活力测定。
PO AHACs传代培养至第四代 (Passagel～Passage4, P1～P4)，倒置相差显微镜下观察各代软骨细胞生长状况，各代均培养至第7天，进行每日细胞计数，描绘P1-P4细胞生长曲线，同时用免疫组化SABC法检测P3AHACs中Ⅱ型胶原的表达，对其进行表型鉴定。
2结果
2.1台盼蓝细胞计数 台盼蓝排斥实验结果显示：消化收集的PO AHACs存活率约为85%。
2.2倒置相差显微镜下AHACs形态学观察 倒置相差显微镜观察显示：原代混杂细胞比较多。P1～P4AHACs大部分可在6小时～12小时内贴壁生长,贴壁后形态由球形逐渐向外伸展出突起而转变为多边形,部分呈三角形、纺锤形和梭形。随着细胞增殖数量增加,细胞体积逐渐增大,形态也慢慢趋于一致,7天～8天达到70%融合，细胞单层黏附生长，仍呈多角形，排列较紧密,折光性强。
2.3细胞计数,绘制生长曲线 P1～P4AHACs生长旺盛，速度较原代细胞增快，大部分可在6小时～12小时内贴壁生长，3天～4天达对数生长期,7天-9天细胞可铺满皿底。Pl～P4AHACs的生长曲线形状较为相似,符合Logistic生长曲线,曲线呈S型,但增殖率有些区别。
2.4 P3AHACs Ⅱ型胶原免疫组化染色 P3AHACs表型鉴定结果显示：胞浆染成棕色,细胞接触部分可见较浅棕色，说明有Ⅱ型胶原的表达。
第二部分：人参皂甙Rg1对P3AHACs增殖及其培养物bFGF表达的影响
1方法 在6孔板中按2×105各/ml接种自培养的P3AHACs，实验分为两组：Rg1组与对照组，对照组用Dullbecco R.改良的Eagle培养基(DMEM培养液)培养，Rg1组在DMEM培养液基础上加用人参皂甙Rg1单体，Rg1终浓度为40μmol/L,37℃、5%CO2培养箱中培养7天。
每日倒置相差显微镜下观察软骨细胞形态学改变，进行每日细胞计数，并绘制生长曲线。培养第7天用SABC法检测Rg1组与对照组中细胞的Ⅱ型胶原表达，阴性对照用D-Hanks液代替一抗,具体步骤同第一部分。
光镜观察细胞染色情况，图象采用Image-Pro-Plus6.0图像分析系统对染色图像进行分析，测得其平均光密度和灰度值。
细胞培养至第7天用酶联免疫吸附法(ELISA)测定Rg1组与对照组的细胞培养上清及细胞超声裂解物中bFGF表达。所有的实验数据以均数±标准差(X±s)来表示，并采用SPSS13.0(USA)软件进行统计学分析，两组细胞增殖数量比较采用重复测量因素方差分析，平均光密度和灰度值及bFGF表达的组间比较均采用独立样本t检验,检验水准α=0.05。
2结果
2.1倒置相差显微镜下AHACs形态学观察
Rg1组与对照组两组细胞均呈多角形、圆形或梭形，胞体丰满,胞浆均匀，Rg1组的细胞数目明显多于对照组，但形态较对照组小且长，胞体也没有对照组饱满，胞核也没有对照组大而圆。
2.2细胞计数，绘制生长曲线。
软骨细胞接种后可出现潜伏期，对照组自第2天起细胞进入对数增殖期，到第7天细胞数约为传代接种密度(第0天)的6倍。Rgl组自第2天起细胞增殖能力增强，到第7天细胞数约为传代接种密度(第0天)的21倍。
Rgl组与对照组增殖符合Logistic生长曲线，曲线呈S型，但Rg1组增殖速度自培养第2天起与有对照组开始有极显著差异(P=0.00<0.01)。
2.3P3AHACs II型胶原免疫组化染色结果
免疫组织化学结果显示：Rg1组和对照组均可见Ⅱ型胶原表达,胞浆染成棕色，细胞接触部分可见较浅棕色。Rg1组与对照组的平均光密度和灰度值没有统计学差异(P=0.692>0.05,P=0.800>0.05)。
2.4P3AHACs培养物内bFGF表达结果
ELISA法测定Rg1组的细胞培养上清及细胞超声裂解物中bFGF表达均高于对照组,但经统计学分析,两组的细胞培养上清有显著差异(P=0.004<0.05),细胞超声裂解物没显著差异(P=0.063<0.05)。
第三部分：人参皂甙Rg1对膝骨性关节炎影响的研究
1方法
30例膝骨性关节炎入选病例,根据随机数字表法分为人参皂甙Rg1实验组、参麦注射液对照组和空白对照组,简称为Rg1组、参麦组和空白组。所有入选患者均采用基础加关节腔注射的治疗方法。
基础治疗主要是患者的健康教育、自我调理及合理的饮食,并配合股四头肌功能训练及中药熏洗。
关节腔注射治疗为每周1次,每次2ml液体,连续5周。空白组注入液体为生理盐水注射液,Rg1组注入液体为150μg/ml的人参皂苷Rg1生理盐水溶液,参麦组为参麦注射液。
通过患者对病情的自我评估、医生评估、患者疼痛VAS可视评估、骨性关节炎指数的评估,计算总分及治疗前后的分值差来判断各组间及组内的差异。
采用SPSS13.0(USA)统计软件进行统计分析,计量资料采用(X±S)表示,治疗前的一般情况资料比较采用单因素方差分析,治疗前后的组内比较采用配对t检验,治疗前后的组间分值差比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05。
2结果
2.1三组患者的一般情况比较结果 三组患者在年龄分布、病程及治疗前总分比较方面均无显著性差异(P=0.947>0.05,P=0.979>0.05,P=0.657>0.05)。
2.2治疗前后组内对比结果 治疗后各组总分分别下降了44分(Rgl组)、46分(参麦组)、30分(空白组),下降比例为40.37%、42.20%、27.02%,均与治疗前比较明显下降,均有极显著性差异(P=0.00<0.01,P=0.00<0.01,P=0.00<0.01)。
2.3治疗前后疼痛VAS评分差值组间对比结果 治疗后各组评分均与治疗前有较一致的下降,Rgl组与空白组,参麦组与空白组,参麦组与Rgl组两两比较后各组间无显著性差异(P=0.453>0.05,P=0.674>0.05,P=0.740>0.05)。
2.4治疗前后关节炎综合指数WOMAC评分差值组间对比结果 治疗后各组评分均较治疗前有下降,Rgl组与空白组有极显著差异(P=0.007<0.01),参麦组与空白组显著差异(P=0.028<0.05),参麦组与Rgl组间无显著性差异(P=0.548>0.05)。
2.5治疗前后总分差值组间对比结果 治疗后各组评分均较治疗前有下降,Rgl组与空白组有显著差异(P=0.045<0.05),参麦组与空白组有显著差异(P=0.019<0.05),参麦组与Rgl组间无显著性差异(P=0.687>0.05)。
结论
1.成功在体外分离培养出AHACs后,获得的P3AHACs增殖能力强,表型稳定。
2.单独应用浓度为40μmol/L人参皂甙Rg1对P3AHACs可具有明显的促进增殖的作用,并可能通过上调AHACs培养物中bFGF的表达起作用。
3.150μg/ml人参皂甙Rg1可改善患者关节功能,提高其生活质量,改善膝骨性关节炎的病情,疗效确切安全,是参麦注射液治疗膝骨性关节炎的有效成分。